發(fā)布時(shí)間：2017-10-11
2017年9月20日，《eLife》期刊在線(xiàn)發(fā)表了題為《自由行為下幼年斑馬魚(yú)快速全腦神經(jīng)活動(dòng)成像》的研究論文，該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心王凱研究組（神經(jīng)科學(xué)研究所）與溫泉研究組（中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)微尺度國(guó)家實(shí)驗(yàn)室）合作完成。該研究發(fā)展了一種新型三維在體成像技術(shù)——擴(kuò)增視場(chǎng)光場(chǎng)顯微技術(shù)（eXtended field-of-view Light Field Microscopy, XLFM），可以對(duì)斑馬魚(yú)幼體的全腦神經(jīng)元進(jìn)行高速神經(jīng)活動(dòng)功能成像。研究團(tuán)隊(duì)將該成像技術(shù)與一套快速三維追蹤系統(tǒng)結(jié)合，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)自由行為下的幼年斑馬魚(yú)進(jìn)行快速全腦神經(jīng)元活動(dòng)記錄，并首次捕捉到斑馬魚(yú)幼魚(yú)在捕食行為下高時(shí)空分辨率的全腦神經(jīng)活動(dòng)。該研究打破了了長(zhǎng)久以來(lái)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域只能對(duì)頭部固定的活體斑馬魚(yú)進(jìn)行全腦功能神經(jīng)活動(dòng)研究這一局限，為研究斑馬魚(yú)幼魚(yú)的感知運(yùn)動(dòng)神經(jīng)環(huán)路提供了一種強(qiáng)有力的工具。
圖1. XLFM斑馬魚(yú)幼魚(yú)全腦成像。（a）XLFM示意圖。微透鏡陣列與物鏡的后光瞳平面共軛。激發(fā)光為470 nm的藍(lán)色激光。（b-c）不同豎直位置的點(diǎn)在相機(jī)上形成不同形狀的圖像，這些二維圖像編碼了物體的三維信息。（d）全腦細(xì)胞核標(biāo)記GCaMP6f（huc：h2b-gcamp6f）的斑馬魚(yú)幼魚(yú)的全腦最大強(qiáng)度投影（MIP）。（e）在t=0時(shí)刻光刺激后斑馬魚(yú)幼魚(yú)不同神經(jīng)元的熒光活動(dòng)圖，根據(jù)神經(jīng)元的響應(yīng)時(shí)間先后順序進(jìn)行排序。（f）（e）中的選定的神經(jīng)元根據(jù)其響應(yīng)的起始時(shí)間被標(biāo)記了不同的顏色。刻度為100微米。
系統(tǒng)神經(jīng)科學(xué)的一個(gè)中心目標(biāo)就是理解動(dòng)物的神經(jīng)環(huán)路活動(dòng)與行為之間的聯(lián)系。近年涌現(xiàn)的一批光學(xué)手段（例如鈣信號(hào)熒光成像、光遺傳學(xué)等）已經(jīng)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域取得了巨大的成功。在此過(guò)程中，斑馬魚(yú)幼魚(yú)因其體積小、光學(xué)透明、行為豐富等特征成為一種理想的模式動(dòng)物。而光片顯微技術(shù)（light-sheet microscopy）、雙光子顯微技術(shù)（two-photon microscopy）已經(jīng)在揭示斑馬魚(yú)行為神經(jīng)環(huán)路機(jī)制上顯示出了強(qiáng)大的潛力。
然而，現(xiàn)有的斑馬魚(yú)全腦神經(jīng)活動(dòng)的記錄都是在頭部固定的活體斑馬魚(yú)上完成的。雖然近年發(fā)展的虛擬現(xiàn)實(shí)技術(shù)（virtual reality）可以通過(guò)監(jiān)測(cè)斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)信號(hào)并在斑馬魚(yú)周?chē)鷮?shí)時(shí)反饋相應(yīng)的虛擬圖像來(lái)模擬自由運(yùn)動(dòng)的場(chǎng)景，但是這種技術(shù)無(wú)法模擬一些較復(fù)雜的行為，例如捕食行為。更重要的是，在虛擬現(xiàn)實(shí)中，斑馬魚(yú)的本體反饋被忽略，而這些本體反饋在感知運(yùn)動(dòng)行為中扮演著重要角色。因此，發(fā)展一套適用于自由行為下的斑馬魚(yú)幼魚(yú)全腦神經(jīng)活動(dòng)記錄的系統(tǒng)成為斑馬魚(yú)研究領(lǐng)域一個(gè)急迫的任務(wù)。
在此之前，自由行為下的全腦成像技術(shù)已經(jīng)在其他小型動(dòng)物例如秀麗線(xiàn)蟲(chóng)上實(shí)現(xiàn)。然而，由于斑馬魚(yú)幼魚(yú)運(yùn)動(dòng)時(shí)的加速度和速度極快，準(zhǔn)確快速地對(duì)其腦部實(shí)現(xiàn)三維實(shí)時(shí)追蹤無(wú)論是對(duì)系統(tǒng)硬件還是算法上都提出了很高的要求。此外，由于斑馬魚(yú)全腦的體積相對(duì)較大，如何在斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)全腦的快速成像也是一個(gè)新的挑戰(zhàn)。對(duì)此，研究團(tuán)隊(duì)從兩方面入手。一方面，他們開(kāi)發(fā)了一套高速三維追蹤系統(tǒng)，成功解決了對(duì)快速運(yùn)動(dòng)的斑馬魚(yú)頭部實(shí)時(shí)追蹤的問(wèn)題。在追蹤系統(tǒng)中，他們分別利用高速相機(jī)和一組特殊設(shè)計(jì)微透鏡實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)斑馬魚(yú)頭部的水平和豎直位置，并將此位置反饋給高速位移臺(tái)和壓電陶瓷做水平與豎直方向的位置校正。另一方面，針對(duì)成像方法，他們創(chuàng)造性地發(fā)展出了一種新型體成像技術(shù)——擴(kuò)增視場(chǎng)光場(chǎng)顯微技術(shù)（XLFM）。該技術(shù)利用一組放置在成像系統(tǒng)傅立葉平面上的微透鏡陣列，可以同時(shí)將物體不同方向的投影成像到相機(jī)上，相機(jī)采集到的圖像經(jīng)過(guò)特殊算法重構(gòu)物體的三維信息。該成像方法不僅成像速度極快，可以以77 Hz的速度記錄斑馬魚(yú)幼魚(yú)的全腦活動(dòng)，而且相較之前的體成像技術(shù)，空間分辨率得到了大幅提高，達(dá)到了3.4 μm × 3.4 μm × 5 μm，在斑馬魚(yú)全腦中已經(jīng)接近單細(xì)胞分辨率。至此，該工作成功解決了斑馬魚(yú)幼魚(yú)的追蹤與成像這兩大問(wèn)題。
進(jìn)一步地，他們將XLFM與高速三維追蹤系統(tǒng)結(jié)合，成功捕捉到了斑馬魚(yú)幼魚(yú)捕食行為下的全腦活動(dòng)。斑馬魚(yú)的捕食行為由于涉及動(dòng)機(jī)、感知、決策、運(yùn)動(dòng)控制、反饋等一系列復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路功能，一直以來(lái)都受到神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)關(guān)注。然而，長(zhǎng)久以來(lái)，人們受限于研究工具一直無(wú)法深入研究捕食行為背后的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制。而該工作的完成恰恰填補(bǔ)了這一缺陷，這將極大地促進(jìn)對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)捕食等復(fù)雜行為神經(jīng)機(jī)理的研究，對(duì)人們更好地理解感知運(yùn)動(dòng)相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路工作機(jī)理具有重要意義。該技術(shù)進(jìn)一步拓展后亦可大規(guī)模監(jiān)測(cè)其他小型動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)。
圖2. 捕食行為中的斑馬魚(yú)幼魚(yú)全腦成像。（a）在捕食行為中的6個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的全腦活動(dòng)（上圖）和對(duì)應(yīng)的低被行為（下圖）。用于定量分析行為的一些參數(shù)包括：斑馬魚(yú)-草履蟲(chóng)夾角、兩眼會(huì)聚角、頭部朝向、斑馬魚(yú)-草履蟲(chóng)距離d。（b）全神經(jīng)系統(tǒng)胞質(zhì)GCaMP6s表達(dá)的斑馬魚(yú)全腦最大強(qiáng)度投影（MIP），四個(gè)感興趣的腦區(qū)的邊界已經(jīng)被標(biāo)出。（c）根據(jù)熒光信號(hào)亮度得到的四個(gè)腦區(qū)在捕食過(guò)程中的神經(jīng)活動(dòng)（上），以及對(duì)應(yīng)的行為參數(shù)的變化（中、下）。
該工作由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心王凱研究員、杜久林研究員與溫泉研究員合作完成，神經(jīng)所助研叢林、杭葦、科大本科生王澤冠、博士生柴宇明為共同第一作者，王凱研究員、溫泉研究員為共同通訊作者，杜久林組副研究員尚春峰、王凱組研究生白璐和溫泉組研究生楊文斌也做出了重要貢獻(xiàn)。
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